摘要:微透析作为一门新兴的生物活体采样技术，具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等优点。目前微透析技术多用于药学领域的药动学(PK)和药动学－药效学(PK－PD)研究方向，其可以直接有效地监测靶组织中内源性或外源性药物动态变化。本文对微透析技术在药学及其他领域中的应用和发展现状进行综述，以更全面的了解该技术。
关键词:微透析;活体取样;药学;其他领域;应用进展
微透析(Microdialysis)取样的基本过程是物质通过半透性中空纤维透析膜的被动扩散，它是对动物模型和人类患者进行近实时组织内化学监测的强大技术。其最早用于研究脑内神经递质的释放［1］，随后发展至对各个组织细胞外液的成分分析中，现如今可被用于监测神经递质、肽、氨基酸、代谢物和激素等。微透析探针经溶液灌注后，小分子通过被动扩散进入探针并被扫到探针出口。出口可以直接连接分析系统，如液相色谱、毛细管电泳或质谱仪，用于在线分析;也可以收集并储存离散的透析液样本，用于以后的离线分析。微透析的一个关键优势是其广泛的应用范围，它可被用于药理学、神经学、生物学和医学等研究领域。在药学领域，许多研究都依赖于对血液、活体组织中药物浓度的测定，其中游离药物发挥真正的药效作用，但传统的检测方法测得的却是结合药物和游离药物的总和，所以之前的检测方法测得的结果无法代表具有药理活性的药物浓度。而利用微透析技术可以直接检测血液或组织中的游离药物浓度，操作简单且可实时观察。微透析是一种研究药代动力学的工具，可在获取组织的药代动力学信息时发挥重要作用。
1关于微透析的概述
微透析技术以半透膜的透析原理为基础，在非平衡条件下对插入组织中的探针进行灌流，待测物质便可经被动扩散进入透析管内，并被管内的灌流液所带出，以一定时间间隔将其有序收集起来就可得到透析液［2］，而后可对透析液进行检测分析，这就是微透析活体取样的过程。微透析与其他取样方法相比，它最大的优点［3］是可在基本保证机体正常生命活动的条件下进行活体连续取样，准确测定游离药物浓度，显示药物在特定时间内浓度变化趋势。而且具有特定分子量的半透膜使透析液中不含有蛋白质等大分子物质，省略了样品前处理的步骤，避免了样品污染和操作误差，提高了实验结果的准确性，同时也提高了科研人员的工作效率。其次微透析技术可在同一动物的不同器官连续同时采样，大大减少了实验动物的数量。除了可以测定机体内的药物浓度，微透析还可以作为一种给药途径，将药物运送至特定靶点发挥药效，这为现代新型给药系统的研究提供了重要方法。但微透析技术也并不是没有缺点，较低的时间分辨率经常被认为是微透析的局限性。但随着时间的推移，各种工作人员通过开发具有较低检测限的精细分析方法来提高微透析的时间分辨率。它还存在其他局限性，如探针的植入会对局部组织造成轻微损伤，影响机体正常生理活动;探针回收率受探针、灌流液、灌流速度以及药物理化性质等因素的影响;取样样品浓度低，体积小，通常需与灵敏度高的检测仪器联用;只适用于水溶性、小分子的物质;成本较高等。如果这些问题得到解决，微透析的应用范围将更为广泛。
2微透析在药学领域中的应用
2．1微透析在PK中的研究进展
微透析技术以其独特的优势获得了国内外科研人员在研究药代动力学这方面的青睐，目前该技术已在脑部、皮肤、血液、关节及其他部位得到广泛研究和应用。2．1．1基于脑部PK的微透析研究微透析在脑组织中的应用最为广泛和成熟，脑微透析技术已在实验室和各种临床研究使用了几十年。作为临床神经监测常规的一部分，脑微透析是一种可以测量脑间质液中多种生物能量代谢物浓度的工具。在脑内药动学方面，是一种能够准确测定游离药物浓度的高灵敏技术。脑间质液中大型治疗分子如单克隆抗体(mAbs)的浓度测定，是神经退行性疾病治疗从临床前物种向人类转化的基石之一。微透析和脑开放血流微灌注是目前唯一可用于提取脑间质液的方法，其用于啮齿类动物大分子物质收集的研究和表征才刚刚起步。LePrieultFlorie等［4］首次从技术和性能层面比较了这两种方法在清醒和自由运动小鼠体内测定非靶结合mAb曲妥珠单抗的脑间质液浓度。王圣鑫等［5］利用脑部微透析结合LC－MS法，对补阳还五汤中的有效成分在中脑动脉阻塞大鼠脑脊液中的浓度变化进行了药动学研究，该实验其他中药复方的药动学研究提供了依据。此外，脑微透析技术在毒品脑局部药动学研究中也有所应用。冰毒即甲基苯丙胺(MA)，是一种强效中枢神经兴奋剂，主要作用于脑多巴胺能和5－羟色胺能系统。单胺氧化酶、儿茶酚O－甲基转移酶和醛脱氢酶2(ALDH2)是多巴胺(DA)和5－羟色胺(5－HT)代谢的重要酶，但ALDH2在MA成瘾中的作用尚不清楚。KimSeungju等［6］为考察ALDH2抑制MA引起的反应，他们首先给予大鼠MA和/或CVT－10216(一种选择性ALDH2抑制剂)，评价其运动活性，然后采用衍生化辅助LC－MS/MS法同时定量大鼠脑透析液中DA、5－HT及其代谢产物。分析结果显示，CVT－10216可显著降低DA水平，且随MA染毒剂量的增加而升高。此外，CVT－10216与MA共同给药后3－甲氧基酪胺水平升高，可能在拮抗MA引起的反应中发挥潜在作用。所有这些发现均提示ALDH2的抑制对MA诱导的高情绪具有保护作用，在MA成瘾中具有治疗潜力。2．1．2基于皮肤PK的微透析研究真皮微透析直接对靶部位皮肤组织液进行采样分析，可以测量局部给药的活性药物成分(API)在真皮中的释放速率和程度，得到的药动学参数可更真实地反映药物透皮性能及其在皮肤的代谢情况。在同一受试对象上使用多个测试点，每个测试点重复探针，用此技术平行比较同一受试对象上不同外用皮肤科药物产品的一种API的皮肤药代动力学是可行的，并且有助于减少变异性。为了解局部剂型在用药后的累积效应，评价微针辅助芍药苷载药醇质体(TGP－E)的治疗效果，探索药物深度渗透的潜力，HuangJiayi等［7］建立微透析结合UPLC－MS法研究大鼠TGP－E经皮药动学。结果表明，微针可以促进醇质体进入皮肤发挥作用，这大大提高了水溶性芍药苷深层渗透的可能性。该发现为实现药物新颖、安全、更有效的剂型和给药途径的开发提供新的见解。LubdaMarkus［8］等为了解不同的理化特性是否会影响活性成分的皮肤渗透及其深度渗透。他们利用微透析技术来比较猪皮肤中浅层和深层植入的微透析膜的经皮渗透，使用组织学切片结合显微镜、超声和新型计算机断层扫描方法确定精确的微透析膜深度。最终结果表明，精确的微透析真皮定位和物理化学特性(如亲脂性)会影响活性成分的渗透率，并且该研究为创建优化的透皮给药系统奠定了基础。王伟等［9］应用微透析技术结合UPLC－MS/MS来研究盐酸去甲异波尔定乳膏大鼠经皮给药的药代动力学。2．1．3基于血液PK的微透析研究血液是最常见的生物检测样本，传统的血液采集方法都会使动物受到不同程度的损害，造成体液损失严重，生理状态与正常机体存在一定差异;并且由于血液成分复杂，内源性物质存在干扰，导致前处理过程复杂，这些问题很大程度上影响了药物研究的准确性和效率。而血液微透析技术可以攻克这些难关，因此其被广泛应用于血液药动学的研究中。FeiYibo等［10］建立了快速、高灵敏度的LC－MS/MS－微透析联用测定全肠外营养(TPN)输注血浆中美罗培南的方法。在优化条件下，将该验证方法应用于同时输注TPN的脓毒症(盲肠结扎和穿刺诱导)家兔体内美罗培南的药代动力学研究，以模拟临床实践。结果表明，微透析辅助的LC－MS/MS法可成功用于TPN输注血浆中美罗培南的测定。刘加瑶等［11］应用微透析结合HPLC研究四逆汤活性成分在大鼠血液和心脏部位的动态变化情况。近些年来，随着微透析技术的不断发展和成熟，基于血液及其他部位的双位点、多位点的微透析应用也越来越广泛。Mi等［12］采用血脑双位点微透析技术，结合UPLC－MS法考察了以血瘀型偏头痛患者为研究对象，不同浓度天麻素和天麻苷元对川芎嗪和阿魏酸药代动力学行为的影响。顾清等［13］应用经体外和体内回收率校正后建立的皮肤血液双位点微透析系统，结合LC－MS来研究苦参碱凝胶在体内的药代动力学。YangChaoNan等［14］为研究均可以治疗和改善帕金森病患者运动功能的氨溴索和远志这两种药物可能在血液和大脑中具有中草药协同作用的假设，他们建立了大鼠血液和脑样品的多微透析系统结合UPLC－MS/MS方法。研究结果显示，该给药方案不存在药动学相互作用，将远志提取物与氨溴索联合使用是安全的。2．1．4基于关节PK的微透析研究关节疾病在人类疾病中越来越常见，因此研究治疗关节疾病的药物十分重要，微透析在这方面发挥了很大的作用。与传统的关节局部药动学的分析方法相比，微透析技术更便捷且更有效。欧咏［15］应用微透析－UPLC－ESI－MS/MS法对大鼠颈静脉，肝脏和膝关节透析液中的小檗碱进行药动学研究。张衡等［16］使用微透析采样技术收集佐剂性关节炎大鼠的关节腔透析液，并结合UPLC－Q－TOF/MS技术探究牛膝总皂苷干预类风湿关节炎的代谢相关机制，结果证明微透析结合代谢组学这种方法可行，有利于下一步深入探讨牛膝总皂苷的作用机制，并且推动了关节靶部位其他药物的发展。2．1．5其他部位PK的微透析研究张强［17］利用微透析技术结合UPLC－MS/MS研究通窍散疲组分方制剂经鼻递药的药代动力学进程。蒋阿梅等［18］应用微透析技术对盐酸倍他洛尔眼药水在兔眼房水的药动学进行评价。冯晋等［19］为研究天麻成分对羟基苯甲醛的胃肠吸收动力学特征，应用HPLC结合微透析取样技术，采用大鼠在体胃肠原位灌注模型考察不同浓度的对羟基苯甲醛在大鼠胃、肠内吸收量的差异，为受试物进一步开发提供数据基础。为了更好地了解抗结核药物的药代动力学，缩短新药和新组合的临床试验所需时间，LanniFaye等［20］建立了优化利福平在豚鼠体内的微透析方法，以更好地了解利福平在肺部的药代动力学。在测定探针回收率并确定肺和骨骼肌中利福平浓度之间的相关性后，采用微透析技术测定豚鼠骶棘肌中利福平，利福平肺浓度由在骶棘肌测定的利福平浓度估算。这项研究表明微透析对确定抗结核药物的药物浓度具有潜在的可用性，以支持新型结核病药物的开发。
2．2微透析在PK－PD中的研究进展
PK－PD结合模型的研究在阐明药物的药效物质基础及其作用机制上具有十分重要的地位。而微透析取样技术在PK－PD研究领域的应用，可实现几乎所有组织的取样，且可以同步测定透析液中药物浓度及药效指标含量，更加准确有效地反应药物浓度与效应的关系，为靶部位PK－PD的研究打开了一扇新的大门。Wang等［21］建立微透析－UPLC－QQQ－MS法测定清醒缺血性卒中大鼠血浆和海马中刺五加含有的药效活性成分和内源性神经活性物质，并将所得数据从PK－PD角度进行分析，建立脑缺血区海马内PK－PD关系的可视化表达方法。DěrgelMartin等［22］为更深入地了解塌陷肺内抗生素的分布对于其有效预防肺炎是必要的。他们在10头麻醉猪经双腔气管插管通气后，采用头孢呋辛(20mg/kg)单次静脉滴注30min来给药，经微透析采样技术收集到的血液和肺透析液，应用超滤、体内反渗透、HPLC－MS法测定游离药物在血浆和间质液浓度，浓度采用非房室分析和房室模型检查，并比较肺塌陷和通气时血浆和肺间质液中头孢呋辛的PK/PD。
3微透析在其他研究领域中的应用
微透析技术因其具有活体连续取样、动态观察等独到的优点，已被广泛运用于脑、皮肤、血液、关节、肺、心肌等PK和PK－PD研究，近年来该技术涉及的领域越来越广，其在生物学、神经学、临床医学及土壤元素含量测定等研究领域也有所应用。
3．1微透析在生物学领域中的应用
临床万古霉素(Van)治疗需要长时间给药以达到持续的治疗效果。准确、快速、持续的Van检测可以为医生在现实环境中调整剂量和治疗计划提供基于数据的指导，但这种医疗监测需求尚未得到满足。因此MuFangya等［23］创建了一种Van特异性荧光生物传感器，结合微透析采样技术开发了一种快速、简单、准确和灵敏的检测方法，并在体内对Van进行了验证。Van特异性探针是通过分别将Van结合肽L－Lys－D－Ala－D－Ala的二聚衍生物的两条肽链中的每一条与荧光丹磺酰氯基团缀合而产生的。在正常家兔和腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭(CＲF)家兔中记录了Van的受试者特异性药代动力学，这表明体内治疗药物监测的可行性。他们建立的该方法有利于临床治疗中Van的持续监测，并且为临床治疗各种疾病时监测血药浓度的其他有效方法提供科学依据。
3．2微透析在神经学领域中的应用
衰老与急性免疫挑战的神经炎症反应增强有关，常被称为“炎症反应”。然而，关于炎症标志物的基线水平是否在老化大脑的环境条件下升高，或者这种变化是否主要是在对急性挑战的反应中观察到的，存在相互矛盾的报道。PerkinsAmyE．等［24］采用两种不同的方法评估年轻和衰老Fischer344大鼠的炎症标志物。其中实验二采用大分子活体微透析技术测定成年(3个月)和老年(18个月)雄性和雌性大鼠海马组织中炎症因子的细胞外浓度。虽然几乎没有观察到与衰老相关的显著变化，但CCL3、CCL20和IL－1α的胞外浓度存在着强烈的性别差异。实验2还通过选择性激动剂BzATP的反向透析评价P2X7嘌呤能受体参与神经炎症反应。BzATP使IL－1α和IL－1β释放增加，并迅速抑制CXCL1、CCL2、CCL3、CCL20和IL－6的释放。在CCL3、IL－1β和IL－6中观察到了其他值得注意的随年龄变化的性别差异。这些发现共同为神经炎症的晚期衰老和性别差异及其P2X7受体调控提供了重要的新见解。
3．3微透析在医学领域中的应用
肝移植术后急性排斥反应的临床和生化表现是非特异性的，往往需要进行一次肝脏活检来验证诊断，但这可能会延误治疗。为研究通过微透析监测肝内葡萄糖、乳酸、丙酮酸和甘油是否可用于预测肝移植后早期排斥反应，vonPlatenAnna等［25］对71名接受肝移植的患者术后使用微透析监测。首先根据标准方案确定1个月内出现急性排斥反应的患者，其次对实验对象每隔12h计算葡萄糖、乳酸、丙酮酸、甘油和乳酸/丙酮酸比率的曲线下面积(AUC)，比较有无排斥反应的患者的这些参数，以及标准的肝血检查和零时间活检。结果显示，肝移植后早期微透析检测到的代谢模式表明原发性缺血再灌注损伤和排斥反应之间可能存在联系，识别这些模式有助于鉴别有发生急性排斥反应风险的患者。
3．4微透析在土壤元素含量测定中的应用
磷是作物必需的营养元素，精确时空施用磷肥可以改善植物磷的获取并减少磷的径流损失。磷的优化施用受益于了解其从肥料颗粒释放到土壤中的动态，这需要对磷进行空间和时间分辨测量其在土壤中的含量。PetroselliChiara等［26］结合微透析和X射线计算机断层扫描来研究土壤中P的迁移。微透析探针能够在最小物理干扰的情况下从一个位置重复进行溶质采样，并且它们的小尺寸允许进行空间分辨监测。结果表明，与传统的测量技术(例如吸盘)相比，微透析测量提供了一种侵入性较小的替代方案。
4结语
微透析作为一种新型的取样技术，拥有相当广阔的应用和发展前景。虽然有一些局限，但在近年来的应用中，微透析技术也在不断改进和完善，并逐渐走向成熟。可以预见，随着其广泛应用和技术的不断发展，将会改变药学及其他领域的研究现状，加速各个研究领域的研究进程并开创它们的新面貌。
作者：杨泞琪 单位：中国刑事警察学院