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慢性中性粒细胞白血病分子诊断探讨

2021-10-29 22:45:01毕业论文访问手机版

慢性中性粒细胞白血病(chronicneutrophilleukemia,CNL)是一种极为少见的BCR-ABL阴性骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferativeneoplasms,MPN),其特征是持续地外周血成熟中性粒细胞明显增多、骨髓粒系增生和肝脾肿大,无髓系细胞发育异常形态改变和BCR-ABL1、PDGFRA、PDG-FRB、FGFR1重排。以往由于缺乏特定的分子标志,本病的明确诊断很大程度上取决于仔细地鉴别反应性粒细胞增多和表现相近的其他髓系肿瘤,基本属于排除性诊断。随着2013年发现大多数患者具有集落刺激因子3受体基因(CSF3R)突变[1],并经严格定义的CNL中验证,确认其为CNL发病分子基础,2016年WHO淋巴与造血组织肿瘤分类中纳入CSF3R突变作为CNL诊断主要指标[2],使得CNL不再是排除性的诊断,而成为一种形态学和分子遗传学定义的髓系肿瘤。现就CNL分子诊断研究进展介绍如下。

1CSFR

CSF3R基因定位于染色体1p34.3,含有17个外显子,编码813个氨基酸的集落刺激因子跨膜受体,为粒细胞提供增殖和生存信号,并有助于其分化和功能。CSF3R是一单链细胞表面受体,属于细胞因子受体Ⅰ型超家族,其胞质部分包括有不同的功能区,即近膜区域有丝分裂信号传导,行使增殖功能;远端区域羧基末端与成熟信号传导有关,行使分化和增殖调节功能[3]。CSF3R与其配体G-CSF结合后,通过经典的下游途径,包括JAK-STAT,SRC家族激酶(尤其是LYN),非受体酪氨酸激酶SYK、Ras/Raf/MAP激酶和PI3K/Akt通路发挥作用,诱导中性粒细胞分化、增殖、存活,并刺激中性粒细胞功能。研究证明CSF3和CSF3R在粒细胞生成过程起着非常重要作用,小鼠缺乏CSF和CSF3R基因缺陷可表现严重的粒细胞缺乏。在严重先天性粒细胞缺乏患者,除了明确的遗传性致病基因(如ELANE或HAX1)突变外,有报道40%可伴有获得性造血干细胞CSF3R胞质远端羧基末端过早截断的基因无义突变,通过与其它癌基因共同作用延长细胞生存,增加克隆优势,被认为与高急性白血病转化相关[4-5]。另外,CSF3R基因胚系突变尚可导致显性遗传的先天性中性粒细胞增多或家族性慢性中性粒细胞白血病[6-7],偶尔在急性髓系白血病也报道检出这种类似突变。

2CSF3R突变与CNL诊断

为了查找潜在的分子发病原因,2013年Max-son等[1]采用原代细胞深度测序结合酪氨酸激酶特异的小干扰RNA或小分子激酶抑制剂作用的方法,对传统临床诊断的CNL和不典型慢性髓系白血病(aCML)进行研究,27例患者中16例(59%)检出CSF3R突变,其中9例CNL患者中8例(89%)检出CSF3R突变,均涉及位于外显子14的胞外近膜结构域点突变,7例(78%)为CSF3RT618I突变,1例为CSF3RT615A突变。这些近膜结构域点突变单独发生更为多见,少部分与另一类导致CSF3R胞质尾部过早截断的移码突变或无义突变共同存在,形成复合突变。胞外近膜结构域点突变和胞质尾部过早截断突变两种类型突变分别通过下游JAK-STAT通路和SRC酪氨酸激酶通路介导,均具有体外转化能力,并相应地对激酶抑制剂芦可替尼和达沙替尼呈现不同敏感性。以CSF3RT618I表达的造血细胞进行移植,小鼠发生致死性的MPN,表现为突出的成熟粒细胞增多、骨髓明显活跃和肝脾成熟粒细胞浸润[8]。Pardanani等[9]在按照严格WHO标准诊断的12例CNL患者中更是100%检出CSF3R基因突变,10例为CSF3RT618I突变;而aCML、浆细胞病相关CNL、原发性骨髓纤维化症(PMF)和慢性粒-单细胞白血病(CMML)患者无一例检出该突变。这些均表明CSF3R突变在CNL非常常见,是CNL一致性的生物学特征;CSF3RT618I是CNL敏感而特异的分子标志,应纳入CNL诊断标准。2016年修订的WHOCNL诊断标准将CSF3RT618I和其他激活突变纳入诊断[2],即:①外周血白细胞计数≥25×109/L,分叶核+带状核中性粒细胞≥80%,前体中性粒细胞(早幼、中幼和晚幼粒细胞)<10%,原粒细胞少见,单核细胞<1×109/L,无粒系形态发育异常;②骨髓增生活跃,中性粒细胞比例及数量增多,中性粒细胞形态正常,原粒细胞占有核细胞比例<5%;③不符合WHO定义的BCR-ABL1阳性慢性粒细胞白血病(CML)、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET),或原发性骨髓纤维化(PMF);④无PDGFRA、PDGFRB或FGFR1基因重排,无PCM1-JAK2融合基因;⑤CSF3RT618I或其他活化CSF3R基因突变,或持续性(≥3个月)的中性粒细胞增多、脾肿大,且没有可识别原因的反应性中性粒细胞增多,包括无浆细胞肿瘤,或者如果存在浆细胞病,须有髓系细胞细胞遗传学或分子学研究证实的克隆性证据。

3继发性或反应性粒细胞增多的排除更为方便

临床上中性粒细胞增多可见于多种良恶性疾病,精确诊断CNL需要仔细与这些具有类似表现的疾病进行鉴别。CML、aCML、CMML以及MPN/MDS等各自均具有特征性分子和细胞形态学特征,诊断也在2016年WHO髓系肿瘤分类中明确界定,与CNL鉴别并不困难。类白血病反应与CNL均可表现有外周血白细胞增多、骨髓增生明显活跃、BCR/ABL融合基因阴性和正常染色体核型,二者的鉴别极具挑战性。尽管仔细地病史询问、临床检查和外周血分析大多可以提供相应诊断线索,但若能证明存在克隆性造血,包括识别出CSF3R突变或其它分子或细胞遗传学异常,则更加支持CNL的诊断。而缺乏CSF3R基因突变虽并不能完全排除CNL诊断的可能性,但此时要诊断CNL更需格外谨慎。CNL经常同时伴发浆细胞病,以多发性骨髓瘤最为常见,意义未定单克隆γ球蛋白血症次之,文献报道可高达32%[10]。鉴于肿瘤性浆细胞可合成G-CSF,CNL能自发缓解,基础浆细胞病治疗中性粒细胞计数改善,患者预期寿命更长,尤其均不能检出特征性的CSF3R基因突变,表明伴发浆细胞病的“CNL”与单纯CNL是两种病因和机制不同的病理异常,支持前者实为浆细胞病继发的中性粒细胞增多[11-12]。另外,某些实体瘤也可易位生成G-CSF,导致副瘤性白细胞增多[13-14],表现与CNL相似,需注意鉴别。

4CSF3R突变类型与CNL临床表现及预后

CNL有两种不同的CSF3R突变类型,一是常见的近膜端突变,主要包括T618I和T615A点突变。膜近端突变阻止CSF3R的O-糖基化,导致活性二聚体构型增加,配体非依赖的受体激活,以及经由JAK2的构成性下游信号传导[15]。已经证明最常见的CSF3RT618I突变经由JAK-STAT途径发挥作用,对JAK抑制剂芦可替尼治疗敏感。另一种是移码突变或无义突变,导致CSF3R的胞质尾端过早截断(D771fs、S783fs、Y752X和W791Z)[1,5]。受体的截断致使负调控基序丧失,包括与受体内化有关的双亮氨酸分选基序,以及靶向并进而降解受体的细胞因子信号传导3(SOCS3)的抑制剂结合位点[16-17],破坏受体转运,延迟受体内化和(或)降解,导致细胞表面CSF3R表达增加,STAT5持续活化,细胞增殖加强[18]。单独的CSF3R的胞质尾端截断突变可能不足以驱动白血病发生,在CNL也极为罕见,对SRC激酶抑制剂达沙替尼治疗敏感[19]。绝大多数CNL呈CSF3R基因近膜端突变,最高约30%的患者同时表达近膜端突变和胞质尾端截断突变的复合突变。CSF3R基因复合突变可诱导小鼠发生侵袭性致死性白血病,并在体外显示对JAK和SRC抑制剂均耐药,而对MAPK信号传导途径抑制剂trametinib更为敏感[20]。最近,Szuber等[21]将19例CSF3R基因突变CNL患者按照突变类型分组为14例T618I突变和5例其它CSF3R基因突变(包括M696T突变2例,T640N突变,c.2215C>T截断突变和I598ISYN突变各1例),比较2组患者的临床特征。结果显示,CSF3RT618I突变患者具有更多的不良临床和实验室特征,倾向于诊断时年龄更大,白细胞计数更高、血红蛋白和血小板计数值更低,以及异常核型发生率更高。这些不良特征最终转化为较其它CSF3R突变类型患者显著降低的整体生存(OS)。

5CNL其它突变基因

除了CSF3R基因突变外,在CNL患者中尚可检测到不同发生频率的其它基因突变,包括ASXL1(47%~77%),SETBP1(0~75%),SRSF2(44%),TET2(20.5%~50%),CALR(5%~12.5%),以及JAK2(8%)等[22-26]。另外,10%左右的CNL患者缺乏CSF3RT618I及其它近膜端基因突变,提示应该尚有另外的基因异常参与其白血病发生。与潜能未定的克隆性造血(CHIP)一致的多种基因突变的检出,促使考虑在CHIP背景下晚发CSF3R突变并最终导致CNL表型的可能性。而Zhang等[27]二代基因测序研究结果显示,超过半数的CNL、aCML、CMML、MPN-U或MDS/MPN-U患者表现出3种不同的途径共同发生突变,涉及染色质修饰、表观遗传调节、剪切复合物和信号传导基因。CNL这种多通路基因突变共同发生的模式与aCML、MDS/MPN-U和CMML非常相似,作者提出该病归类为MDS/MPN较MPN更为合适。CNL是一少见的MPN,临床表现异质性非常高,在缺乏疾病特异性标志时代其精确诊断具有极大挑战性。2013年CSF3R突变与CNL发病因果关系的阐明导致CSF3R突变纳入修订的WHOCNL诊断标准,并随之发现其它相关基因。这些CNL致病基因突变的识别不仅丰富了分子诊断方法,也为基于此的靶向药物研发奠定了基础。

作者:张凤奎 宋琳